jueves, 27 de febrero de 2014

Cómo preparar un tampón fosfato potásico

Últimamente en mis experimentos he cambiado de cultivo. Antes me centraba en tomate, maíz, alubia, lechuga, soja y puntualmente, tabaco. En estas plantas he llevado a cabo mis investigaciones en los últimos años pero ahora, he añadido un cultivo más para mí totalmente nuevo: el arroz.

Planta de arroz | FUENTE

Esta novedad supone modificar algún que otro protocolo porque a la vista de los resultados, el arroz (mira que me gusta... comérmelo!) me está dando algún problema y no se somete a mis métodos analíticos. A esto, hay que sumar que muchas determinaciones que antes se hacían con un espectrofotómetro ahora se hacen con otro tipo de tecnología mucho más moderna, fiable y rápida, y frecuentemente hay que estar cambiando las formas de hacer las cosas. Es decir, optimizando los métodos y protocolos. Por ejemplo, donde antes usábamos 100 microlitros de muestra, ahora es suficiente con 5. 


Infinite(R) 200 PRO NanoQuant microplate reader. Es decir, una maravilla
de máquina que lo lee todo en un minuto y te quita horas de trabajo.


Tengo la buena o mala costumbre de revisar todos los cálculos y unidades de los protocolos, incluso si lo he hecho yo. Por un lado, me sirve para comprobar que a mí me sale igual (si el protocolo no es mío) y por otro, para no olvidar problemas de química básica. Sin embargo en ocasiones, compruebo que algún cálculo está mal y rápidamente se corrige explicándole al autor dónde está el fallo y por qué. 

Un tampón, buffer, solución amortiguadora o solución reguladora es la mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido débil y su base conjugada, es decir, sales hidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes. Este hecho es de vital importancia, ya que con un leve cambio en la concentración de protones (H+) en la célula se puede producir un paro en la actividad de las enzimas. 

Este post no es más que una pequeña ayuda por si os viene bien para aquellos que en algún momento tengáis que preparar tampón fosfato potásico (abreviado, PK) a una concentración X y un pH determinado. Directamente os pongo "mi chuleta" de hace 12 años y que en un plástico ya viejuno, la voy sacando cada vez que tengo que preparar un buffer. 

Hay tablas por internet y en los manuales donde se prepara el tampón partiendo de dos soluciones (1 y 2) y añadiendo la sol. 2 a la 1. Es igual de válida. 

NOTA: Los cálculos están hechos para una molaridad de 1 y un pH de 7 pero el desarrollo es el mismo con otra molaridad y otro pH siempre que respetemos que la unidad es Molar (moles/litro) y el volumen para el que da los datos es 1 litro. Es decir, si queremos un tampón PK 50 mM, pondremos 0.05 M.



Click para ampliar. 


Y dejadme que os dé un consejo aplicable al trabajo: Nunca, nunca, deis algo como bueno sin repasarlo y confirmar que está bien antes de ponerlo en práctica. Haciendo las cosas bien ahorraréis dinero, tiempo y disgustos. Es vuestro trabajo.

PD: Perdonad la letra y la falta de alguna unidad. Me resultaba más cómodo subir la foto que escribir aquí ecuaciones. 

37 comentarios:

  1. Muchas gracias por la chuleta y sobre todo por el consejo.

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  2. Si se prepara el tampon y tiene un pH inferior a 7 se puede ajustar con NaOH?

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    1. Acabo de ver tu comentario Anónimo, disculpa. Se me había pasado!

      A ver, un tampón o buffer no es lo mismo que una solución que tengas que preparar a un pH determinado. No se prepara únicamente haciendo los cálculos del peso del reactivo y modificando el pH con una base o un ácido para subirlo o bajarlo, como ocurre con el EDTA 0.5M pH 8 o el MOPS.
      Requiere un cálculo diferente. Es una solución amortiguadora y además del pH, tiene pKa que hay que considerar para que la ecuación esté en equilibrio.

      Por tanto, y respondiendo a tu pregunta, si preparas el tampón como debes hacerlo, no será necesario ajustar el pH a nada. Ya está el cálculo hecho como para que añadiendo los gramos y el volumen de agua necesario, el pH sea el que tiene que ser ;-)

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    2. Pues te cuento que no es tan así como tu lo relacionas aquí, pues al mezclar las cantidades que relacionas me pasa lo mismo, no obtengo el pH deseado. Además, si tu proporción de agente ácido es más grande que la de agente básico, tu pH tenderá a bajar por los principios del equilibrio químico.

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    3. Hola Camilo.
      Como digo en el post, esta es una de las formas. La otra, es preparar las soluciones por separado en base a los datos que ofrecen algunas tablas en libros y manuales (en función del pKa y el pH) y añadir una solución en otra. Vamos, mezclarlas.

      Si no tienes el pH deseado (depende de cuál te salga y lo grande que sea la diferencia) puede ser por los reactivos utilizados. Si no tienen pureza del 100%, si están hidratados con X moléculas de agua (cosa que hay que tener en cuenta en el peso molecular) o si la diferencia es pequeña, que se deba a errores de arrastre de decimales a lo largo de toda la ecuación.

      Obviamente, como dices, si el ácido es más que la base, el pH bajará. Y si es al contrario, subirá.

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  3. y si quiero preparrar un buffer a ph 5.2, como le hago?

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    1. Con esta misma ecuación teniendo en cuenta que tienes que poner 5,2 en pH (en vez de 7 como viene aquí) y el pKa del buffer correspondiente. Si me hablas de tampón fosfato potásico, solo sería sustituir el valor de pH.

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  4. Hola buenos días:

    He revisado tu cálculo y aparentemente todo va bien. Sin embargo y como dice Anónimo en el primer comentario, el pH que se logra mezclando las cantidades que tu refieres es aproximadamente de 6.5, a pesar de que los cálculos matemáticamente estan bien. No es error de pesada, no es error de sustancia ni nada, ya lo he elaborado 5 veces y todas me ha dado el mismo pH. ¿Tienes una explicación para este hecho? Gracias.

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    1. Hola.

      Como le he contestado por ahí arriba a la misma cuestión, no te puedo decir exactamente a qué puede deberse esa diferencia. Descartamos error de pesada entonces. Nos quedan los reactivos. Te has fijado en la pureza de los reactivos y el peso molecular? ¿están hidratados? ¿has tenido eso en cuenta para los cálculos? A veces, es una tontería de nada. ¿el pHmetro es fiable? ¿está recién calibrado? ¿las soluciones de calibración están bien?
      Sinceramente no se me ocurre otro motivo por el que te pueda pasar. A mí no me ocurre y en mi entorno al menos, no veo que nadie haya tenido esas diferencias de pH.

      Como te digo, la otra forma, es combinar las dos soluciones que vienen en algunos manuales y libros para que prepares por separado. Pero en realidad se basa en el mismo principio.
      Depende de para qué estés usando ese buffer, pero también te digo que de 6.5 a 7 no hay mucha diferencia de pH y cuando se trata de un pH fisiológico del medio que sea suele ser variable dentro de un rango.

      Un saludo.

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  5. El agua de dilución es una solución que se prepara para realizar a nivel de laboratorio la prueba de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO5) y estimar la cantidad de materia orgánica que puede ser oxidada por los microorganismos. Sin embargo es una solución especial que requiere de cierta cantidad de nutrientes y que su pH se conserve en un rango entre 6.5 y 8.5 unidades. Para ello esta solución debe tener un comportamiento del tipo amortiguador, donde se emplea un sistema fosfato, que además aporta el fósforo necesario para que los microorganismos logren mantenerse en el medio. Entonces si se necesita preparar 2 L de agua de dilución a una concentración de 0.5 M y un pH de 7, ¿qué cantidades se requieren pesar de KH2PO4 (fosfato monobásico de potasio) y K2HPO4 (fosfato dibásico de potasio)?

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    1. Tienes la ecuación en este post. Sustituye los datos de molaridad manteniendo el volumen de 1 L y los gramos que te dé, los multiplicas por dos para 2 L.

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  6. Hola, no sé si me contestarás ya que la entrada es antigua pero yo lo intento. No entiendo de qué depende la molaridad. Necesito hacer un tampón de fosfato sódico de ph 7, y por tanto tengo que calcular la concentración de cada especie, es decir mi incógnita son los gramos que necesito. De que depende que sea 1M o 50 mM?? En que influye eso sí lo único que me interesa es el pH? Como se la relación que necesito de esa molaridad si solo me han dicho que prepare un buffer pH 7?? Muchas gracias

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    1. Hola Ana.
      En el tampón fosfato sódico pH7 que tienes que preparar, tienes que saber a la fuerza a qué concentración lo necesitas. 50 mM, 1M... lo que sea. Si no sabes eso, no podrás prepararlo. Aunque te interese el pH, la concentración es importante. Imagina, no es lo mismo añadir una cucharada de azúcar a un vaso de agua que 30 cucharadas.
      Tiene que haber algún dato que te haga saber esa molaridad. Si no te lo han dicho explícitamente quizá ponga algo del tipo *usar la molaridad de la tabla X* No sé, algo.

      Mira bien o pregúntalo. Una vez lo sepas, es fácil.
      Un saludo.

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  7. Buen día, entonces si quiero preparar una solución buffer de fosfato de potasio monobásico 50mM y pH 4.5, entonces puedo usar los mismos datos de pKa, pero cambiando los datos de pH y molaridad deseada ¿cierto?

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    1. Cierto. Debes poner la molaridad en Molar (no milimolar) y sustituir el pH.
      El tampón que quieres preparar es muy ácido, no? Para qué lo vas a usar?

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  8. hola, no entendi como saca el valor del fosfato dibasico de fosfato, gracias.

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    1. Hola Anónimo.

      ¿Qué valor? ¿El peso molecular o los gramos finales que hay que añadir?

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  9. Como puedo preparar un Amortiguador de fosfato de potasio pH=7.3
    Suplementado con 20mM de edta, 2mM MgCl2, 30 mM KCl y 2℅ de BSA. Estoy muy confundida, sería muy buena su ayuda.

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    1. Tienes los datos incompletos. Para preparar el buffer necesitas saber a qué concentración lo quieres. No lo dices.

      Y respecto al resto de cálculos, usa la fórmula de la molaridad (M= número de moles/ volumen). Es algo bastante básico.

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  10. Tengo una pregunta, a partir de fosfato potásico y fosfato dipotásico puede calcularlo perfectamente de la misma forma que tu arriba. Pero tengo que preparar el tampón usando unicamente fosfato monosódico y o bien HCl o bien NaOH. ¿Cómo se haría?

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    1. Me falta información. Lo que me dices no me cuadra. El tampón fosfato sódico, sí. Se prepararía así (teniendo en cuenta su pKa) pero el "o bien HCl o bien NaOH" no entiendo. Suena más a que son los reactivos con los que se baja o se sube el pH de la solución (respectivamente). No se puede elegir entre uno y otro de forma arbitraria. Es un ácido y una base, no tienen nada que ver entre sí

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  11. Hola necesito preparar una soluciones de buffer de fosfato de potasio a un pH 7.2 y otro a un pH de 8.6 con un Molaridad 0.1. Tengo fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) con un peso molecular de 136.09 y el fosfato de potasio dibásico (K2HPO4) con un peso molecular de 174.18, me podrías ayudar a hacer el cálculo? De antemano gracias

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    1. Ok. Te voy a ayudar pero lo vas a hacer tú. Son dos buffers a distinto pH, así que primero uno y luego el otro igual. Tienes todos los datos y el pKa es 7.2 para los dos. Por tanto,

      Buffer A:
      pH 7.2
      pKa 7.2
      M =0.1

      Buffer B:
      pH 8.6
      pKa 7.2
      M= 0.1

      Vuelve a la fórmula de arriba, la del post y sustituye por tus valores.
      Céntrate en

      pH = pKa + log [A]/[AH] donde
      A es el fosfato dipotásico (174.18 gr/mol)
      AH es el fosfato monopotásico (136.09 gr/mol)

      Ve haciendo y me cuentas :-)

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  12. Estuve leyendo este Post, y la variación de pH del Buffer depende del pH del agua que se está empleado para fabricar el Buffer. Revisar el tema en el libro de bioquímica de Lenhinger. de preferencia emplear agua desionizada.

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  13. Hola,

    trabajo en una empresa que prepara reactivos para analizar vinos y queríamos empezar a fabricar tampones de calibración de ph de 4.00 y 7.00, me valdrían estos cálculos para ambos tampones? y la estabilidad del patrón es larga? (1/2 años) la idea sería fabricarlos y venderlos a nuestros clientes así que tiene que ser un producto fiable. muchas gracias de antemano

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    1. Hola Ana,
      Yo diría que no. Esos cálculos están pensados para preparar una solución tamponadora formada por un ácido y una base, pero en realidad no sé cómo se preparan los tampones de calibración de un pHmetro (ya vienen preparados de fábrica...)

      Siento no poder ayudarte más. Quizá esta página te pueda dar algo de luz
      http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=5033

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    2. gracias! echare un vistazo a ver si nos sirve de algo

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  14. Muchas gracias por su colaboración con los distintos profesionales que realizamos ese tipo de cálculos

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  15. Hola Amara.
    Necesito preparar una solución antiséptica con hipoclorito.Entiendo que añadiendo el tampón a dicha solución podría mantener el PH de tal manera que no dañara los tejidos vivos.En este caso sería mantener el PH a 10.5 para estabilizar la solución de hipoclorito.
    Gracias

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    1. Hola Javier,

      No entiendo. Entiendo que la solución antiséptica sería de hipoclorito sódico, probablemente al 0,1%% pero no entiendo por qué mezclarla con un buffer. ¿Cual es el uso que le vas a dar a la solución antiséptica? Más que antiséptico, creo que se usa como desinfectante...
      Te dejo esta página que habla de antisépticos y desinfectantes. De todos, yo solo uso el etanol al 70% para superficies y manos.
      http://www.funlarguia.org.ar/Herramientas/Guia-de-Prevencion-de-Infecciones-Intra-Hospitalarias/Uso-de-Antisepticos-y-Desinfectantes

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  16. Buenas,solo espero que me ayude porque no entiendo muy bien este problema. ¿Qué volúmenes necesitaría de NaH2PO4 0.2M y Na2HPO4 0.2M para preparar 10 mL de un amortiguador fosfato. ph=7, sabiendo que su pK=7.2

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    1. Y la molaridad final del amortiguador ¿cuál es?

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  17. Hola Amara.
    El fosfato monopotásico hidrogenado lo puedo conseguir en tiendas de productos agrícolas pero no sé dónde puedo encontrar el dipotásico.
    Podrías indicarme.Gracias.

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    1. Hola Javier,
      No lo venden en el mismo sitio que el monopotásico? Mmmm pues no sé decirte, la verdad. He hecho una pequeña búsqueda en varias webs y tampoco lo veo. Noto que los fertilizantes ya vienen preparados "ready to use" más que los compuestos químicos por separado.
      Quizá preguntando en esas tiendas donde sí está el monopotásico te puedan decir algo...

      Siento no poder ayudarte más.

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  18. Hola Amara,

    Me parece muy claro el cálculo que haces, solo que necesito preparar 200 ml de tampón, en que punto tengo que tener en cuenta el volumen final? Entiendo que los 0.631 mol/L en este punto yo tendría que dividir los 0.631/0.2 L y obtendría el número de moles para después multiplicarlo por su PM y obtener los gramos a pesar. Se hace de esta manera?

    Muchas gracias

    Un saludo

    Raquel

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    1. Hola Raquel,

      Puedes hacerlo de dos formas:
      1. Como tú dices, solo que no sería dividir 0.631/0.2 sino hacer una regla de tres. Si hay 0.631 moles en un litro, habrá X moles en 0.2 l. (fíjate que no es dividir, sino multiplicar 0.631 por 0.2)

      2. Hacerlo todo igual que en la chuleta hasta el final. Todas las ecuaciones parten de la base de trabajar con molaridad como unidad de medida y esto es por definición moles por un litro. Puedes arrastrar esto hasta el final y cuando tengas los gramos (de la forma que tú describes en tu comentario) por litro, haces una regla de tres para 0.2 litros o para el volumen que tengas que preparar.

      Como prefieras. ¡Suerte!

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